Спектрофотометр не проходит по точности длины волны

Почему может быть слишком высокая ошибка длины волны у УФ спектрофотометров? Почему спектрофотометр не проходит поверку? Почему спектрофотометр не проходит по фармакопейным и / или валидационным требованиям к точности шкалы длин волн? Разберемся в этой статье.

При поверке спектрофотометров в подавляющем большинстве случаев заявляется погрешность установки длины волны не более +- 1 нм. При квалификации / валидации по фармакопейной статье 2.2.25 устанавливается критерий +- 1 нм для УФ области (до 400 нм вкл.) и не более +- 3 нм для видимой области (более 400 нм не вкл.).

1. Выставлен слишком большой шаг сканирования спектра

При большом шаге сканирования спектра прибор пропускает большие интервалы длин волн (например, каждые 2 нм) и грубо объединяет полученные измеренные точки оптической плотности.

Из-за этого получаются «рубленные» спектры и максимум может попасть совсем не на то место, где он должен был бы быть. Признаком той же проблемы будут являться значения максимумов с подозрительно идентичными значениями в разных параллелях.

Эта характеристика может называться по разному: шаг сканирования, скорость сканирования или иначе. Это чисто программная настройка.

2. Выставлена слишком широкая щель

Широкая щель в монохроматоре приводит к низкой разрешающей способности. Низкая разрешающая способность приводит к «сливанию» пиков на спектре между собой, отчего если пик был не симметричный, то его максимум сместится вправо или влево.

Увеличьте разрешение / выставьте меньшую длину волны (не всегда наименьшую).

Эта характеристика далеко не всегда доступная к настройке в спектрофотометрах и может называться также по разному: разрешающая способность, ширина щели, ширина линии или иначе. Это аппаратная настройка прибора.

3. Некорректное обнуление прибора

Спектрофотометр должен быть обнулен:

— строго на тех же настройках, что и производится измерение;

— на действительно холостой пробе: для твердотельного светофильтра — это воздух, для жидкостного светофильтра — это холостой жидкостной светофильтр, для раствора — это растворитель в той же кювете. И никак иначе.

— на тех же включенных лампах, что и производится измерение.

4. Источник излучения не стабилизировался

Тут все понятно, не спешите. Дайте прибору хотя бы 30 мин на стабилизацию для наилучших результатов.

5. Некорректно идентифицированные максимумы поглощения

Приблизите очень сильно верхушки максимумов поглощения на спектре. Максимумы действительно совпадают с автоматически определенными максимумами?

Не редко ПО некорректно определяет максимумы и причина может быть столь прозаична.

6. Источник излучения вышел из строя

Такое бывает, особенно для дейтериевых ламп. Правда в данном случае обычно нарушаются и другие характеристики — хотя бы дрейф нуля.

Замените лампу, стабилизируйте 30 мин, повторите тест.

7. Ваш прибор не соответствует требованиям

К сожалению это очень распространенная проблема, несмотря на заявления производителей в спецификациях и наличием поверок. Особенно часто эта проблема встречается среди российских и белорусских спектрофотометров. Не редко проблема имеется в дешевых спектрофотометрах из Китая.

Технически, для спектрофотометра значительно сложнее обеспечить нужную точность в УФ области. Это обусловлена принципами работы монохроматора. Поэтому зачастую прибор выходит за границы допусков именно в области до 400 нм.

При этом, большинство твердотельных светофильтров позволяют тестировать при поверке точность длины волны где-то от 350 нм, что очевидно является недостаточным для подтверждения соответствия в диапазоне до 200 нм.

Для более представительного подтверждения соответствия шкалы длин волн используют:

— гольмиевые твердотельные светофильтры (первый пик обычно около 280 нм);

— гольмиевые жидкостные светофильтры или фармакопейный раствор перхлората гольмия (первый пик обычно около 240 нм);

— цериевые жидкостные светофильтры или фармакопейные раствор церия (первый пик обычно около 201 нм).

Обычно тестирование от 201 нм является избыточной задачей, т.к. сложно найти реальную задачу с такой длиной волны, но тестирование от 250 нм — более чем достаточно. Обычно на этих длинах волн действительно вскрываются проблемы с точностью длины волны, не обнаруживаемые при поверке, где используются твердотельные светофильтры от ~350 нм.

Для представительного тестирования шкалы длин волн, начиная с УФ-области, подойдёт гольмиевый жидкостной светофильтр.

Гольмиевый жидкостной светофильтр соответствует, в том числе фармакопейным требованиям и имеет доказанный срок годности в 2 года.

Ранее также мы производили цериевые жидкостные светофильтры (от 201 нм), но они были сняты с производства в связи с отсутствием спроса. Если у вас есть высокая потребность именно в таких светофильтрах, обратитесь к нам, мы сможем изготовить вам их по индивидуальному заказу.

В этой статье мы разберем проблемы при проверке (поверке, калибровке, валидации, квалификации, периодических проверках работоспособности) инфракрасных (ИК) Фурье спектрометров (FTIR):

— почему не проходит точность шкалы волновых чисел?

— почему не проходит разрешающая способность?

— почему не проходит соотношение сигнал-шум?

— почему не проходит тест нуля (рассеянного света)?

Разберем в первую очередь не проблемы с самим прибором, а то что встречается чаще — ошибки оператора, который проводит проверку. Причины будут располагаться в порядке увеличения вероятности и частоты встречаемости. Начнем с основного теста на точность шкалы волновых чисел.

1. Почему не проходит тест на точность установки волновых чисел?

1.1 Выставлена слишком плохая разрешающая способность

С учетом того, что критерием для точности шкалы волновых чисел является +-1 см-1 от номинала, то самая большое значение в параметре разрешающей способности, которое следует устанавливать, является 4 см-1. Если прибор не проходит на этом значении — надо использовать 2 см-1 и менее до момента пока тест не пройдет. Полученное значение является нормой для работы вашего ИК-спектрометра.

1.2 Выставлено слишком малое значение накоплений

Накопления позволяют компенсировать нестабильность работы прибора путем усреднения получаемых значений. Желательно не выставлять менее 16 усреднений на измерение.

Аподизация, как правило, не дают никакого системного эффекта в точности шкалы волновых чисел.

1.3 Проверка ведется на приставке нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО, ATR), а не приставке пропускания

Проверка точности шкалы волновых чисел должна вестись исключительно на приставке пропускания, даже если вы используете в работе другие приставки. Это кстати причина, почему эта приставка как правило идет по умолчанию в комплекте — она нужна для контроля работоспособности прибора.

Использование для теста точности шкалы волновых чисел распространенной приставки НПВО очень не желательно. Подавляющее большинство ИК спектрометров имеют очень слабую чувствительность на этой приставке и получаемый спектр слабо различим с шумом. Про точность в таких случаях речь не идет. По-хорошему, если вы хотите получить адекватные результаты для проверки на такой приставке, вам нужно использовать стандартную пленку полистирола толщиной 70-90 мкм.

1.4 Программное обеспечение не верно помечает максимумы поглощения

Не редко, программно найденные максимумы пиков не являются максимумами. Максимально приблизите полученный спектр и проверьте вручную полученные числа с визуально наблюдаемыми.

1.5 Не стабилизировался источник излучения

Это банальная причина, но не редко ей пренебрегают, а она реально может быть причиной не прохождения данного теста и других тестов.

1.6 В ИК-спектрометре или его приставках повреждены солевые окна

Окна, которые защищают внутренности прибора от попадания грязи и пыли, сделаны не из стекла или кварца, которые не пропускают ИК излучение, а делаются из различных неорганических солей. Периодически лаборатории желая самостоятельно провести обслуживание спектрометров, влажной тряпкой протирают эти окна, чем создают разводы на этих окнах и пропитывают их водой. Также влага может попасть внутрь приборов.

Обычно эта причина проявляется локально — в повышенной погрешности только в области 3000 см-1 на спектре.

1.7 Используется стандартная пленка полистирола другой толщины, чем у той, для которой установлены критерии

Спектр в некоторой степени зависит от толщины используемой стандартной пленки полистирола. Так, например, фармакопея устанавливает критерии для пленки толщиной около 35 мкм. Использование значительно более толстой пленки смещает пики на несколько десятых волновых чисел, что может выйти в итоге за края допусков.

1.8 Износ источника излучения

Хотя у ИК спектрометров достаточно стабильный источник излучения, но все-таки раз в несколько лет он теряет свою интенсивность и в нем может нарушаться состав спектра. Если все причины были исключены, а прибор ранее хорошо проходил этот тест — замените источник излучения.

Если же у вас новый прибор и он не проходит по критерию — проверьте на другой стандартной пленке полистирола, а если проблема подтвердится — значит проблема в исполнении спектрометра.

2. Почему не проходит тест на разрешающую способность ?

В данном случае под этим тестом понимается либо тест на стандартной пленке полистирола ~35 мкм, где вычисляется разница между максимумами и минимумами при определенных пиках, а также тест, где анализируется полуширина пика углекислого газа.

2.1 Выставлено слишком плохое значение разрешающей способности и число накоплений

Та же самая причина, что и для предыдущего теста и то же самое решение. Надо выставлять 4 см-1 или 2 см-1. Обычно этого хватает.

То же с накоплениями — не менее 16 шт.

2.2 Максимумы и минимумы находятся в строго определенных точках спектра пленки полистирола

Про что речь? Обычно для этого теста указывают, что надо найти разницу оптической плотности в максимуме при 2849,5 см-1 и минимуме при 2870 см-1 и аналогично для другой пары волновых чисел. Но при вычислении этой разницы, максимумы и минимумы не находятся идеально точно в этих значениях. Надо найти фактические максимумы и минимумы (например, они окажутся в точках 2849,75 и 2870,60 см-1) рядом в указанных местах спектра и вычислить разницу между значениями оптических плотностей для них. Это очень частая причина у новичков.

2.3 Использована слишком тонкая стандартная пленка полистирола

Наблюдаемся разница оптических плотностей между максимумами и минимумами контрольных пиков в пленке полистирола будет снижаться при уменьшении толщины пленки. Критерии не менее 0,33 Б и 0,08 Б в фармакопее, даны для пленки толщиной около 35 мкм. Использование пленки 30 мкм (0,03 мм) даст неверные результаты. Использование пленки более толстой — более 40 мкм — даст наоборот завышенные не реалистичные показания.

Подходящую по фармакопейным требованиям стандартную плёнку полистирола толщиной 35 мкм можно заказать в каталоге.

3. Почему не проходит тест на соотношение сигнал-шум

3.1 Использована другая приставка

Данный критерий чаще всего установлен для приставки пропускания ИК спектрометров. У приставки НПВО (ATR) как правило соотношение сигнал-шум в разы хуже, чем у приставки пропускания. Поэтому для контроля данного соотношения для приставки НПВО, необходимо устанавливать отдельный критерий.

3.2 Использование иной методики, чем той, для которой было установлено данное соотношение

Количество накоплений очень сильно влияет на данный тест, поэтому нужно понимать для какого количества накоплений установлен данный критерий. Обычно для данного теста необходимо выставлять количество накоплений от 32 до 64.

Диапазон вычисления шума также очень сильно определяет величину шума. Чем больше выбранный интервал в области 2200 см-1, тем с большей вероятностью вы получите бОльший шум при использовании метода pick-to-pick (p2p). P2p — это самый простой и самый грубый метод вычисления шума, когда шум вычисляется как разница между наибольшей и наименьшей значениями точек спектра.

Метод вычисления шума. Чаще всего используется вышеприведенный метод p2p, но могут использоваться также методы 6-sigma, 3-sigma или какой-то более специфичный.

Используемая формула может быть несколько отличаться у разных разработчиков методик. Вроде бы она должна быть одинаковая, но все равно отличается в том числе из-за разного способа вычисления шума.

Это главная причина, почему зачастую при проверке соотношения сигнал-шум для ИК-спектрометра, получаемое значение даже близко не приближается к тем десяткам тысяч, а то и значениям более 100 тысяч, которые пишет у себя производитель в спецификациям. Относитесь к спецификациям производителя достаточно скептически, при установке собственного критерия к соотношения «сигнал-шум».

3.3 Сигнал-шум делается на пленке полистирола

Тест соотношения сигнал-шум делается на воздухе, а не на стандартной пленке полистирола.

3.4 Вышел из строя источник излучения

Соотношения сигнал-шум не является в большинстве случаев действительно важным критерием, т.к. он влияет только на количественные измерения очень малых концентраций, что происходит крайне редко для ИК спектрометрии. Но данный критерий в динамике позволяет отслеживать работоспособность источника излучения и менять его заблаговременно, не дожидаясь, когда выйдут другие характеристики.

4. Не проходит тест нуля (тест рассеянного света)

Здесь все просто: если проблема не связана с большим выставленным значением для разрешающей способности, то это аппаратная проблема или проблема обнуления. Если прибор «из коробки» дает значения более 1 % (спектр пропускания) для контрольных пиков, то это особенность прибора.

Но данный тест не является критичным для большинства назначений, не нормируется в фармакопее и установлен только в методиках OMCL.

Если вдруг вы ищете полностью подходящую для проверки ИК-Фурье спектрометров стандартную плёнку полистирола толщиной около 35 мкм, рассмотрите стандартный образец в каталоге.